|
|
Charakterizace vazebného rozhraní komplexu transkripčních faktorů FOXO4 a p53
Brzezina, Adam ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Tato práce se zabývá studiem lidských transkripčních faktorů FOXO4 a p53. FOXO4 je členem podrodiny "O" FOX transkripčních faktorů. Geny kódující FOXO proteiny jsou evolučně konzervované mezi druhy. FOXO transkripční faktory regulují expresi genů, které se podílí na řízení metabolismu, buněčného cyklu a buněčné proliferace, přežití buněk a odolnosti vůči stresu. Pro svou schopnost zastavit buněčný cyklus a vyvolat apoptózu jsou považovány za tumorové supresory. Jejich funkce v rámci tumorigeneze se však ukazuje být složitější, protože nedávné studie poukazují na horší prognózu vývoje nádorů, u kterých je vyšší hladina exprese FOXO4. Protein p53 je důkladně studovaným přirozeně se vyskytujícím tumorovým supresorem. Buněčná odpověď po jeho aktivaci je do jisté míry podobná jako v případě FOXO4, rovněž umí blokovat progresi buněčného cyklu nebo vyvolat apoptózu v závislosti na buněčném typu a závažnosti/typu buněčného stresu. FOXO4 i p53 se ukazují být klíčové molekuly ovlivňující stárnutí. Za stresových podmínek spolu p53 a FOXO4 interagují, a společně tak zvyšují expresi proteinu p21, čímž indukují přechod buněk do senescentního stavu. Akumulace senescentních buněk je považována za jednu z hlavních příčin stárnutí a rozvoje s věkem spojených patologií. Tato bakalářská práce vznikla jako součást...
|
|
|
Utilization of protein radical foootprinting for stuctural biology
Polák, Marek ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Junková, Petra (oponent)
(In Czech) Mapování povrchu proteinů je jednou z metod strukturní biologie, které poskytují důležité informace o struktuře, dynamice, funkci a vazebných interakcích proteinů. V této práci jsme se k mapování povrchu proteinů rozhodli využít unikátní přístup, kterým je kombinace hmotnostní spektrometrie s rychlou fotochemickou oxidací proteinů (FPOP, z anglického Fast Photochemical Oxidation of Proteins), která k tomuto účelu využívá reaktivní radikály kyslíku. Konkrétně byla v této práci metoda FPOP využita ke studiu interakce proteinu s DNA a to přesněji komplexu DNA-vázající domény proteinu FOXO4 s oligonukleotidem DAF16. V první fázi projektu byl produkován a purifikován protein, jehož vazba na DNA byla ověřena nativní elektroforézou a nativní hmotnostní spektrometrií. Dále byly optimalizovány podmínky oxidace proteinu, a to jak v přítomnosti DNA, tak samostatně a modifikace proteinu byly analyzovány hmotnostní spektrometrií pomocí přístupů top-down a bottom-up. Přístupem bottom-up byla identifikována a kvantifikována modifikovaná residua, což odhalilo rozdíly v oxidaci jednotlivých aminokyselin v přítomnosti a nepřítomnosti DNA. Aby se předešlo možným artefaktům způsobených analýzou vícenásobně oxidovaného proteinu, byla kromě hmotnostně spektrometrické analýzy standardním přístupem bottom-up...
|
|
|
Studium interakce C-konce DNA-vazebné domény FOXO4 s DNA
Zusková, Iva ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Teisinger, Jan (oponent)
Forkhead transkripční faktory jsou strukturně příbuzné molekuly obsahující přibližně 110 aminokyselin-velkou konzervovanou DNA-vazebnou doménu známou jako forkhead doména. Protein FOXO4 náleží do podskupiny "O" forkhead transkripčních faktorů. Zástupci podskupiny FOXO forkhead transkripčních faktorů se podílejí na mnoha důležitých biologických procesech. FOXO faktory se účastní kontroly metabolismu, buněčného cyklu, apoptózy a ochrany vůči oxidativnímu stresu. DNA-vazebná doména členů FOXO se skládá ze tří α-helixů (H1, H2 a H3), tří β-vláken (S1, S2 a S3) a dvou flexibilních ohybů (nazývaných jako křídla W1 a W2). Úloha ohybu W2 při vazbě FOXO na DNA je nejasná. Ohyb W2 pravděpodobně interaguje s oblastí DNA předcházející hlavní vazebný motiv FOXO faktorů. Spekuluje se, že vazebná afinita DNA-vazebné domény FOXO4 k DNA roste s obsahem A-T párů v oblasti DNA předcházející hlavní vazebný motiv. Pro ověření této hypotézy byla exprimována a purifikována DNA-vazebná doména FOXO4 a byla určena její vazebná afinita ke třem různým DNA duplexům lišících se obsahem A-T párů v oblasti před hlavní vazebnou sekvencí. Vazebná afinita byla určena pomocí měření změn stacionární anisotropie fluorescence. Toto stanovení neukázalo žádné signifikantní rozdíly mezi vazebnou afinitou DNA-vazebné domény FOXO4 k DNA o...
|
|
|
Experimental verification of in silico predicted protein binder to FOXO4 transcription factor and transcriptome analysis of bladder cancer
Tauš, Petr ; Drbal, Karel (vedoucí práce) ; Převorovský, Martin (oponent)
Tato diplomová práce je rozdělená na experimentální a bioinformatickou část, které jsou spolu provázány přes transkripční faktory z rodiny 'forkhead box O' (FOXO). FOXO mají klíčovou roli v mnoha buněčných procesech, jako například v regulaci buněčného cyklu, apoptózy a metabolismu. Dlouhou dobu byly považovány pouze za nádorové supresory, ale vzrůstající počet studií poukazuje i na jejich pronádorovou roli. Z tohoto důvodu jsou intenzivně studovány jako potenciální terapeutické cíle v nádorových onemocněních. In silico predikce protein-protein interakcí se v poslední dekádě těší vzrůstající oblibě jak v základním výzkumu, tak při vývoji nových léčiv. Nicméně výsledky v mnoha případech stále nejsou dostatečně přesné při srovnání s očekávanými vlastnostmi predikovaných biomolekul. V této práci jsem pomocí termoforézy v malém měřítku ověřil vazbu čtyř in silico predikovaných vazebných proteinů, založených na přirozeně se vyskytující PDZ doméně k transkripčnímu faktoru FOXO4. Neinvazivní nádory močového měchýře představují heterogenní onemocnění, u kterého se i přes veškeré snahy stále nedaří přesně predikovat agresivita daného nádoru. V bioinformatické části této práce jsem na základě transkriptomických dat z pacientských vzorků nádorů močového měchýře popsal složení nádorového mikroprostředí a určil...
|
|
|
Studium mechanismu rozpoznávání DNA transkripčním faktorem FOXO4
Zusková, Iva ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Bouřa, Evžen (oponent)
Forkhead transkripční faktor FOXO4 se podílí na kontrole řady buněčných dějů, jako jsou např. metabolismus, buněčný cyklus, apoptóza, oprava poškozené DNA či ochrana vůči oxidativnímu stresu. Krystalová struktura DNA-vazebné domény tohoto proteinu s navázanou DNA ukázala, že FOXO4 interaguje s DNA podobně jako jiné forkhead proteiny. DNA- vazebný povrch je tvořen zejména helixem H3, který se váže do velkého žlábku molekuly DNA, a dále N-koncovým segmentem a flexibilními ohyby na C-konci domény. Nicméně řada otázek, zejména ohledně mechanismu regulace specifičnosti při rozpoznávání DNA a úlohy jednotlivých částí domény v tomto procesu, zůstává stále nejasná. V rámci této diplomové práce byla studována interakce DNA-vazebné domény FOXO4 s DNA o různých sekvencích. Tento protein a řada jeho mutantů byla exprimována a purifikována a interakce s DNA byly studovány pomocí metod fluorescenční spektroskopie a resonance povrchového plasmonu. Výsledky těchto experimentů ukázaly, že nukleotidová sekvence na 5′ konci od hlavního vazebného motivu ovlivňuje stabilitu komplexu DNA-vazebné domény FOXO4:DNA. Dále se podařilo objasnit význam jednotlivých aminokyselin FOXO4, které se podílejí na vazbě na DNA, na stabilitě výsledného komplexu.
|
|
|
Studium interakcí forkhead box O (FOXO) transkripčních faktorů s DNA
Hofmanová, Adéla ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Tato práce se zabývá studiem "O" podskupiny FOX transkripčních faktorů, která sestává ze čtyř zástupců (FOXO1, FOXO3, FOXO4 a FOXO6). Jedná se o významné regulační molekuly, které hrají zásadní roli v kontrole buněčného cyklu, odpovědi organismu na stres, diferenciaci a apoptóze. Na základě jejich schopnosti vyvolat buněčnou smrt jsou obecně považovány za tumorové supresory. Nedávné studie však ukázaly, že jejich působení může mít i opačný účinek, tedy že mají schopnost podpořit vývoj nádoru, či vyvolat rezistenci na léčiva používaná při léčbě některých typů národů. Přes intenzivní výzkum zůstává řada otázek týkajících se funkce FOXO proteinů stále nezodpovězená. Jednou z nich je, zda drobné strukturní rozdíly pozorované v jinak vysoce konzervovaných DNA-vazebných doménách (DBD) jednotlivých zástupců FOXO transkripčních faktorů mají vliv na DNA-vazebnou afinitu. Dále pak, zda má nedávno popsaná protein-proteinová interakce FOXO-DBD s transkripčním faktorem p53 vliv na jejich DNA-vazebné vlastnosti, nebo jaký je význam vazebného místa pro Mg2+ ion nalezeného v krystalové struktuře komplexu FOXO4-DBD:DNA. Pro objasnění těchto otázek byly exprimovány a purifikovány DNA-vazebné domény lidských transkripčních faktorů FOXO3 a FOXO4 (FOXO3-DBD142-267 a FOXO4-DBD82-207). Pomocí změn stacionární anisotropie...
|
|
|
Utilization of protein radical foootprinting for stuctural biology
Polák, Marek ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Junková, Petra (oponent)
(In Czech) Mapování povrchu proteinů je jednou z metod strukturní biologie, které poskytují důležité informace o struktuře, dynamice, funkci a vazebných interakcích proteinů. V této práci jsme se k mapování povrchu proteinů rozhodli využít unikátní přístup, kterým je kombinace hmotnostní spektrometrie s rychlou fotochemickou oxidací proteinů (FPOP, z anglického Fast Photochemical Oxidation of Proteins), která k tomuto účelu využívá reaktivní radikály kyslíku. Konkrétně byla v této práci metoda FPOP využita ke studiu interakce proteinu s DNA a to přesněji komplexu DNA-vázající domény proteinu FOXO4 s oligonukleotidem DAF16. V první fázi projektu byl produkován a purifikován protein, jehož vazba na DNA byla ověřena nativní elektroforézou a nativní hmotnostní spektrometrií. Dále byly optimalizovány podmínky oxidace proteinu, a to jak v přítomnosti DNA, tak samostatně a modifikace proteinu byly analyzovány hmotnostní spektrometrií pomocí přístupů top-down a bottom-up. Přístupem bottom-up byla identifikována a kvantifikována modifikovaná residua, což odhalilo rozdíly v oxidaci jednotlivých aminokyselin v přítomnosti a nepřítomnosti DNA. Aby se předešlo možným artefaktům způsobených analýzou vícenásobně oxidovaného proteinu, byla kromě hmotnostně spektrometrické analýzy standardním přístupem bottom-up...
|
|
|
Experimental verification of in silico predicted protein binder to FOXO4 transcription factor and transcriptome analysis of bladder cancer
Tauš, Petr ; Drbal, Karel (vedoucí práce) ; Převorovský, Martin (oponent)
Tato diplomová práce je rozdělená na experimentální a bioinformatickou část, které jsou spolu provázány přes transkripční faktory z rodiny 'forkhead box O' (FOXO). FOXO mají klíčovou roli v mnoha buněčných procesech, jako například v regulaci buněčného cyklu, apoptózy a metabolismu. Dlouhou dobu byly považovány pouze za nádorové supresory, ale vzrůstající počet studií poukazuje i na jejich pronádorovou roli. Z tohoto důvodu jsou intenzivně studovány jako potenciální terapeutické cíle v nádorových onemocněních. In silico predikce protein-protein interakcí se v poslední dekádě těší vzrůstající oblibě jak v základním výzkumu, tak při vývoji nových léčiv. Nicméně výsledky v mnoha případech stále nejsou dostatečně přesné při srovnání s očekávanými vlastnostmi predikovaných biomolekul. V této práci jsem pomocí termoforézy v malém měřítku ověřil vazbu čtyř in silico predikovaných vazebných proteinů, založených na přirozeně se vyskytující PDZ doméně k transkripčnímu faktoru FOXO4. Neinvazivní nádory močového měchýře představují heterogenní onemocnění, u kterého se i přes veškeré snahy stále nedaří přesně predikovat agresivita daného nádoru. V bioinformatické části této práce jsem na základě transkriptomických dat z pacientských vzorků nádorů močového měchýře popsal složení nádorového mikroprostředí a určil...
|
|
|
Studium interakce forkhead transkripčního faktoru FOXO4 s DNA a s proteinem 14-3-3
Vácha, Petr ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent) ; Krůšek, Jan (oponent)
UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA Katedra fyzikální a makromolekulární chemie Autoreferát doktorské práce Studium interakce forkhead transkripčního faktoru FOXO4 s DNA a s proteinem 14-3-3 RNDr. Petr Vácha Školitel: Prof. RNDr. Tomáš Obšil, Ph.D. Praha 2015 Abstrakt Tato doktorská práce se zabývá studiem interakcí lidského forkhead transkripčního faktoru FOXO4 s DNA a s regulačním proteinem 14-3-3. Hlavním cílem této práce byla detailní charakterizace interakce DNA-vazebné domény proteinu FOXO4 se dvěmi kanonickými sekvencemi DNA a dále objasnění úlohy proteinu 14-3-3 v procesu regulace funkce FOXO4. Transkripční faktory FOXO jsou účinnými aktivátory transkripce genů, čímž ovlivňují celou řadu buněčných procesů. Protein FOXO4 patří do rodiny forkhead transkripčních faktorů, což je skupina několika desítek proteinů, jejichž společným znakem je velmi konzervovaná DNA-vazebná doména. Podstata DNA-vazebné specifity těchto proteinů, tedy co přesně determinuje drobné odlišnosti ve vazebných vlastnostech jednotlivých forkhead proteinů, je i přes množství dostupných strukturních dat stále nejasné. Proto byla provedena detailní charakterizace interakcí mezi DNA-vazebnou doménou proteinu FOXO4 a DNA pomocí rezonance povrchového plazmonu (SPR) a časově- rozlišené fluorescenční spektroskopie. Výsledky...
|
|
|
Studium interakce mezi DNA a transkripčními faktory pomocí hmotnostní spektrometrie.
Slavata, Lukáš ; Man, Petr (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent)
Transkripční faktory hrají v rámci buňky i celého mnohobuněčného organismu zásadní regulační úlohu. Důležitým faktorem, je jejich schopnost interagovat s ostatními regulačními proteiny a DNA. Přesto, že rozsáhlá část této interakční sítě je již zmapována, detailních informací o struktuře a dynamice protein-proteinových a protein-DNA komplexů je dosud velmi málo. V této práci jsme se zaměřili na možnosti studia konformačních změn daných tvorbou komplexu transkripčního faktoru s DNA pomocí strukturních metod hmotnostní spektrometrie: vodík/deuteriové výměny a chemického sítění. Jako modelový transkripční faktor jsme vybrali FOXO4, jehož DNA vazebná doména je strukturně dobře charakterizovaná jak ve volné formě, tak v komplexu s DNA (In Czech).
|
host ::
RSS.